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CHIP-seq

ChIP-seq,指的是结合位点分析法,作用为研究体内蛋白质与DNA相互作用。染色质免疫共沉淀技来自术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。

将ChIP与第二代测序技术相结合的C360百科hIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互村时响慢作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组校慢条湖得个担每上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

  • 中文名称 结合位点分析法
  • 外文名称 Chromatin Immunoprecipitation,ChIP
  • 简称 ChIP-seq
  • 作用 研究体内蛋白质与DNA相互作用
  • 技术支持 染色质免疫共沉淀技术

实验流程

来自  (1)甲醛交联整个细胞系(组织),即将目标蛋白与染色质连结起来;

  (2)分离基因组DNA,并用超声波将其打断成一定长度的小片段;

  (3)添加与目标蛋白质特异的抗体,该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体;

  (4)去交联,纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本,准备测序;

  (5)将准备好的样本进行深度测序。

生物信息分析流程

批呼  (1)将测序得到的短序列片段匹配到参考基因组序列上。

  (2新通粒们王得云)有一部分短序列不能匹配到360百科参考基因组上,有对识就律传可能是未知的基因组序列;另一部分是能够匹配到基因组上的短序列,通常要对这些短序列进行覆盖度计算。

  (3)从匹配到基因组上的短序列中进行富集区域的扫描。通常扫描到的富集区即被认为是蛋白质与DNA相互结合的区域(也有假阳性位点等的影响)。

  (4)对扫描到的富集区做深度分析,包括基因,GO注释,利用基因浏览器进行可视化浏览,研究与基因结构的关系等

研究内容

测序

  对客户提供的ChIP样品(如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的)进行定量检测,检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇(Cluster generation)扩增、高通量测序。

基本数据分析

 厂东均亲尽介今苏之至 数据产出统计:对测序结果进行图像识别(Base calling),去除污染及接头序列;统计结果包括:测定的序列(Reads)长度、Reads数量、数据产量。

高级数据分析

  标准高级数据分析内容严打聚别黑心包括:

  (1)ChIP-Seq序列与参考序列比对;

  (2)Peak calling:统计样品Peak信息(峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数);

  (3)统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度阶轻耐松伤断选太意胞束;

  (4)给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释;

  (5)在多个样品间,对与Peak关联基因做差异分析。

应用领域

  由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果,为研究渐得尔能市波田商者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源,研究者可以在以下几方面展盾临茶还众厚样河大开研究:

  (1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种算究苗局预今直先等组蛋白修饰;

  (2)检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位;

  (3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系;

  (4)CTCF转录因子研究。

案例分析

  ChIP-S来自eq案例研究

  Ell360百科en Markljung等利用ChIP-Seq技术,发现:家猪IGF2基因(编码Insulin-like growth factor 2)第三内含父获呼等谁尔真需子单碱基G→A的替换,导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失,从而使IGF2在骨骼肌中上调表达(表达量是正常情况的3倍),这一突变主要影响肌肉生长(提高了骨骼肌的数量,因此猪肉产量提高了3~4%)、心脏增大和脂肪沉积。

  ZBED6基因与ZBED6蛋白

  ZBED6基因:是失去转座功能的转座子,在所有哺乳动物中怀笔未温察存律境土皮行位于ZC3H11A基因第一内含子中;该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。Real-time-PCR分析显示器坐质硫光药混飞首半件,小鼠Zbed6 题由力常营投岁强条热mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。

  ZBED6蛋字持永阿航白是首次报道。ZBED6操养同水际论输守蛋白含有2个BED结构域和1个hATC二聚结构域;第61~80位和第231~248位氨基酸残基是2个细胞核限难益洲随基电缺侵氧定位信号(富Lys-Arg区段,KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI)。该蛋白在哺乳动物中高度保守,尤其是DNA结合BED结构域,在26个物种中(包括家猪)显示出~100%相似性。

  ZBED6蛋白作为抑制因子调控基因表达的方式

  用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的Zbed6基因沉默后的相关实验结果,证实了ZBED6蛋白作为抑制因子是通冲县兰犯海析检止声看过与位于Igf2基因第三内点伟所含子中的QTN(Quantitative trait nucleotide)位点结合来抑制Igf2基因的表达。当Zbed6基因沉默后,Igf2基因的表达量升高、细情富衣心元动呼虽胞增殖(肌管形成)加快、创伤愈合加快。

  为了音么绿未研究ZBED6蛋白作用靶点(Igf2基因及其下游基因),作者采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析。AB SOLiD测序得到:

  倒世难比①24million reads(比对到小鼠基因组上)型没只音,2,499 Peaks;大多数峰(Peaks)集中在Igf2基因内含子中的QTN位点,即,QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的和笔无衡架主要结合位点(图1)。

  ②GO注释分析发现,ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用(图2)。其中,262个靶基因编码转录因子,36个含有Homeobox结构域,26个属于bHLH(basic helix-loop-helix)家族,10个属于FOX家族,8个细胞核受体,7个属于SOX家族(图3)。

  综上所述,IGF2基因突变的家猪和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌细胞的表型效应、高度的知钱序列保守、核定位、广泛的组织分布、许多靶基因有重要的生物学功能,这一系列现象说明:在哺乳动物中,ZBED6是一个重要的转录因子,影响着发育、细胞增殖和生长。

  图1 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果(A)Igf2基因内含子QTN位点ChIP-Seq Peak跟投端谁混训基县分布

  图2 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果(E)Gene Ontology分类

  图3 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果(F)ZBED6蛋白结合的转录因子家族

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