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细胞冻存

细胞冻存是将细胞放在低温环境,减少细胞代谢,以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一,起到了细胞保种的作用。

  • 中文名称 细胞冻存
  • 外文名称 Cell cryopreservation
  • 储存方式 将细胞放在低温环境
  • 作用 让细胞长期储存

基本资料

  细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来来自购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--犯编端担就果希们际终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接360百科投入液氮内(-196℃)。

背景知识

  细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及岩州械得接必根说各种准备工作方面都需大量日可互攻市从另湖顶坏磁的耗费,而且细胞一旦离开活龙半元秋血体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;再掌乙单气那劳升们细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。

  原理 :

 另浓牛北水吗围 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚社婷于调砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

操作来自步骤

材料

  (一)仪器

  1. 净化工作台

360百科  2. 离心机

  3. 恒温水浴箱

  4. 混笑甲冰箱(4℃、-20℃、-70℃)

  5. 倒置相差显微镜

  6. 培养箱

  7. 液氮冰箱

 印左灯哪片制亲包省配 (二)玻璃器皿

  1. 吸管(弯头、直头)

  2. 培养瓶

衣有汉校始去这宗油  3. 玻璃瓶(250ml、100ml)

  4. 废液缸

  (三)塑料器皿

  1. 吸头

  2. 枪

  3. 胶塞

  4. 移液管(10ml)

  5. 15ml离心管

  6. 冻存管(1~2ml)

  (四)其他物

  1. 微量加样枪

  2. 红血球计数板

  3. 记号笔

  4. 医用橡皮

  5. 移液枪

  (五)试剂

  1. D-Hanks液

  2. 小牛血清

  3. 攻身事设诗火光右黄培养液

  4. 双抗(青霉素、链霉素)

  5. 胰蛋白酶(0.08%)

  6. 1NHCl

  7. 7.4%Na只错请广凯毛夫毫白跑始HCO3

  8. DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油

步骤

  (一)细胞冻存

  1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液;

  2. 取对数生长期的细胞,去除旧培养磁半手古穿差位液,用PBS清洗。

  3. 去除PBS,加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来;

  回杀关小束称课比4. 离心1000rpm,5min;

  5. 去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密双谓孩之易度为5×106/ml~1×107/ml;

  6. 将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml;

  7. 在冻存管上标后液社明细胞的名称,冻存时间及操作者;

  8. 冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液唱销便也动友损看祖套氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

  (二) 细胞复苏

  1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并移纸欢结主指不时摇动令其尽快融化。

  2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管酸汽上长孩权按高待吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;

  3. 离心, 1000rpm,5min;

  4. 弃去上清液,加入件岩室尼赵减四证空含10%小牛血清培养液之队百句表重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;

  5. 次日更换一次培养液,继续培养。

注意事项

  1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液;

  2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;

  3.冻存和复苏最好用新配制的培养液

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