南方墨点法

南方墨点法(英语:So远正uthern blot)，此方法的命名源自其发明者生物学家Edwin Southern。南方来自墨点法(墨点或称印迹)是探测一个DNA样品中含有特定DNA序列的方法。首先，DNA样品为凝胶电泳所分离;然后，分离的样品通过毛细现象被转移席剂拿到一张膜上，这一过程被称为"印迹"。带有样品的膜就可以用与目标序列互补的标记的DNA标记探针来探测。最初的操作手册大都采用放射性标记，但现在非放射性标记已开始被采用。自从PCR技术被用于检测特定DNA序列后，Southern印迹法在实验室中的应用大为减少。但此方法依然有着其他一些应用，如用于测量转基因鼠的转基因拷贝数，以及用于构建基因敲除的胚胎干细胞360百科系。

• 中文名称 南方墨点法
• 外文名称 Southern blo
• 利用 胶体电泳
• 详细介绍 详见正文
• 发明者 Sir Edwin Southern

简介

　　通常，先利用胶体电泳分离脱氧核糖核酸(DNA)样本中各种不同大小的分子。不同大小的分子在胶体电泳之后，会分离而散布在胶体上不同的位置。接着，这些DNA分子可以利用虹吸作用，转染到一个薄膜上，经由DNA变性使它们的双股分开。因为双股DNA已经固定在薄膜上，所以变性后无法再形成双股螺旋;来自然后将上述薄膜暴露在杂360百科交探针(probe)里，让探针和DNA杂交(hy家南念友艺既倒高丰张bridize)。严场信红失杀齐孩家齐话探针是被会产生放射线、或可以放出颜色或萤光的物质标记的单股DNA或核糖核酸(RNA)片段;最后是观察结果。薄膜上可以侦测到放射性或者萤光讯号的位置，就是含有可以与探针核酸序列进先居是级大轴体行偶合的去氧核糖代风核酸样本散布的位置。

　　类似的逐士心板点生技术也被用来侦测经由胶体电泳分离的样品中，含有特定序列的RNA片段，当应用在R银过晚孙司友NA的侦测时，被称为北方墨点法。

基本原理

　　Sou住无倒导教错常滑察附觉thern杂交是利用标记的探针(probe)与转印膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。杂交过程是高度特异性的,可以根据所管感月化必我给友足使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测。

基本过程

　　从细胞或至组织中用酚/氯仿反复抽提蛋白质并用无水乙醇沉淀的方法制备基因组DNA(gDNA);限制性酶切基因组DNA;将酶切产物电泳分离(electrophoretic separation);毛细转印或电转印并固定于NC膜或尼龙膜上;在膜上与标记探针杂交;洗膜后可观察杂交结果。

实验服校怀交工菜等执经养步骤

制备待测DNA样品

　　将新鲜组织研磨成匀浆收集细胞或培养好的细胞用胰酶处理后收集，先反复用酚处理细胞两次后，加入氯仿抽提蛋白质。用乙生目深酸铵和无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗涤一次，加入TE缓冲液溶解。在用琼脂糖凝胶电泳确认基因组DN延件A成功提取后，加入依异李足青限制性内切酶消化，过夜反应。

琼脂糖凝胶电泳

　　制备0.8%-1.0%的凝胶，用0.5*TBE作电泳缓冲液，根据胶的长度，在1V/cm的尼京食笑蛋验约季丝代划电压下电泳，至上样缓冲液(如溴酚蓝等)到达特定位置停止。

DNA变犯般聚夫足性

　　DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好，可避免DNA降解。将凝胶在脱嘌呤液中浸泡20min(视靶序列是否大于5kb，若大于则需要此步骤)，室温轻轻晃动至溴酚蓝从蓝变黄。洗涤一次后在变性液中浸泡30min,再在0.5*变性液中浸泡20min，即可进行Southern转印。

Southern转印

　　这里介绍两种常用的转印方法:毛细转印和电转印法。

　　[编辑]毛细转印法 早期Southern blot是使用毛细转印法，经虹吸作用，转移到NC(硝酸纤维)膜上。

　　在搪瓷盘中加入300ml 1题即运0×SSC，放上培养皿和小玻前直自璃板;将3张长滤纸直状浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡;切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶走滤纸与胶之间的气泡;再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡;紧贴凝胶四周各放一张X光片;小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动;用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜;整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10cm;在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜。[编辑]电转印 转印法经过改良后，快速简便的电转印法如今应用的更加普遍。

　　将胶平放于干净投影胶片上;裁剪一张与胶同大小的尼龙膜或NC膜，用0.5*TBE浸湿后小心平铺在胶表面，用玻璃棒出去凝胶和膜之间的气泡;裁剪6张同样尺寸的滤纸，用0.5*TBE浸湿后平铺于膜上，用玻璃棒去除气泡;在胶的另一面同样铺上6层0.5*TBE浸湿的滤纸，除气泡;将"滤纸-尼龙膜(NC膜)-凝胶-滤纸"转印装置移入电转印仪中，使膜面向阳极，凝胶面向阴极，室温下，100mA转印60min。

膜的固定

　　取出膜在2*SSC中浸泡20min。将膜DNA面朝上置于滤纸上，再覆盖一张滤纸，60℃烤膜30min。

杂交和洗膜

　　将膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭4-6小时。倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。再将膜放在洗膜溶液I(2*SSC、0.1%SDS)中,室温洗2次,每次摇动10min。再在洗膜溶液II(0.5*SSC、0.1%SDS)中漂洗2次, 每次摇动20min。

检测

　　将膜在洗膜缓冲液中漂洗3分钟;在封闭缓冲液中室温摇动封闭30分钟;在抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟;用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟;将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时;当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE洗去底物液，干燥保存。

影响杂交的因素

待检核酸分子

　　浓度越大,复性速度越快,敏感性越高来自;分子越大,转膜越困难,敏感性越低;转膜方法

探针的性质

　　对于单链探针,浓度越高,杂交率增加;探针标记方法和检测方法的选择;

体积、温度360百科和杂交时间

　　体积越小,杂交动力学越高;DNA/DNA杂交适宜的复性河温度为比Tm低20~25℃;温度越低，非特异性越高;温度越高，敏感性越低;

杂交液的离子强度

　　低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+的作用);高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完全同源的杂交时,必须维持杂罗井吧粉经制兵放扬交液与洗膜液中较高的盐浓度若另村;

非特异性杂交反应

　　杂交前封闭膜上应松门宪孙离征非特异性杂交位点,减少其对探针的非特异吸附

杂交后的漂洗

　　期培防灯及川酸盐浓度、温度、次数、体积

固相膜的选择

　留愿　阳离子尼龙膜

参见

　　蛋白质电泳等电聚焦北方墨点法西方墨点法

参考书籍

　　Michael T. Madigan, John M. Martinko, 尽查斤加本雨集凯备Jack Parker著,《BROCK BIOLOGY OF MICROORG曾厂露斯见曾面守适ANISMS》10th ed., Prentice Hall, 2003, ISBN 0-13-066271-2Leland H.Hartwell, Leroy Hood, Michael L.Goldberg,et al.《Genetics》2nd ed.,Mc Graw Hill Higher Education,2004,ISBN 0-07-246248-5